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基線(xiàn)：基線(xiàn)是早期循環(huán)的噪點(diǎn)水平，通常在第3和第15循環(huán)之間測(cè)量，這是因?yàn)樵诖似陂g還檢測(cè)不到擴(kuò)增產(chǎn)物引起的熒光值增加。用于計(jì)算基線(xiàn)的循環(huán)數(shù)量是可以改變的，如果使用高模板量或者靶標(biāo)基因的表達(dá)水平高則循環(huán)數(shù)量需要減少。設(shè)置基線(xiàn)需要查看線(xiàn)性度擴(kuò)增曲線(xiàn)的熒光數(shù)據(jù)。設(shè)置基線(xiàn)，使得擴(kuò)增曲線(xiàn)的增長(zhǎng)所開(kāi)始的循環(huán)圈數(shù)大于基線(xiàn)循環(huán)zui高圈數(shù)。對(duì)每個(gè)靶標(biāo)序列都需要單獨(dú)設(shè)置基線(xiàn)。早期循環(huán)檢測(cè)到的平均熒光值需要從擴(kuò)增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去。各種real-timePCR軟件的版本允許單個(gè)樣品自動(dòng)優(yōu)化基線(xiàn)設(shè)置。

本底：是指反應(yīng)中的非特異性熒光值，例如，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板。信號(hào)的本底分量由real-time PCR軟件算法數(shù)學(xué)除去。

報(bào)告基因信號(hào) ：在real-time PCR過(guò)程中由SYBR Green或熒光標(biāo)記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)。

歸一化報(bào)告信號(hào)（RN）：這是報(bào)告染料熒光強(qiáng)度除以在每個(gè)循環(huán)中測(cè)量的被動(dòng)參照染料的熒光強(qiáng)度。

被動(dòng)參比染料 ：在某些real-time PCR中，熒光染料ROX被用作熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準(zhǔn)確、孔位置及熒光波動(dòng)造成的變動(dòng)。

閾值：閾值調(diào)整到本底值之上并顯著低于擴(kuò)增曲線(xiàn)的平穩(wěn)值。它必須處于擴(kuò)增曲線(xiàn)的線(xiàn)性區(qū)域內(nèi)，代表了PCR檢出的對(duì)數(shù)線(xiàn)性范圍。閾值應(yīng)在對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線(xiàn)視圖中進(jìn)行設(shè)置，以使PCR的對(duì)數(shù)線(xiàn)性期易于識(shí)別。如果real-time PCR中有多個(gè)目標(biāo)基因，閾值必須為每個(gè)目標(biāo)進(jìn)行設(shè)定。

循環(huán)閾值(CT)或交叉點(diǎn)（CP）：擴(kuò)增曲線(xiàn)穿過(guò)閾值的循環(huán)（即，熒光檢測(cè)值顯著增加的點(diǎn)）。CT可以是一個(gè)分?jǐn)?shù)，并且可以計(jì)算起始模板量。

ΔCT值： ΔCT值描述了靶標(biāo)基因和相應(yīng)的內(nèi)參基因CT值的差值，例如看家基因，并用于標(biāo)準(zhǔn)化模板的使用量：

ΔCT = CT (靶標(biāo)基因) – CT (內(nèi)源性參比基因)
ΔΔCT值：ΔΔCT值描述了感興趣樣品（例如，刺激細(xì)胞）的平均ΔΔCT值與參考樣本（例如，未刺激細(xì)胞）的平均ΔΔCT值之間的差值。參照樣品也被稱(chēng)為校準(zhǔn)樣品，并且所有其它樣品進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)都將被標(biāo)準(zhǔn)化到如此：
ΔΔCT = 平均ΔCT (感興趣樣品) – 平均ΔCT (參比樣本)
內(nèi)源性參比基因：e這種基因的表達(dá)水平在樣品間不存在差異，例如看家基因(3)。對(duì)比內(nèi)參基因與靶標(biāo)基因的CT值可以將靶標(biāo)基因的表達(dá)水平歸一化到輸入的RNA或cDNA的量（見(jiàn)上面關(guān)于ΔCT值部分）。反應(yīng)中模板的確切數(shù)量不確定。內(nèi)參基因?qū)σ韵虑闆r作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量、逆轉(zhuǎn)錄效率、核酸回收和樣品處理的變動(dòng)。為了選出*的參照基因（多個(gè)），我們對(duì)算法進(jìn)行了改進(jìn)，允許其選擇依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)設(shè)置*參照（4）。

內(nèi)參：在同一反應(yīng)中被作為靶序列擴(kuò)增的，并用不同的探針（即，進(jìn)行雙重PCR）檢測(cè)的對(duì)照序列。內(nèi)參經(jīng)常被用來(lái)排除失敗的擴(kuò)增，例如沒(méi)有檢測(cè)到目標(biāo)序列的情況。

標(biāo)定樣品：在相對(duì)定量中使用的參比樣品（例如，源自細(xì)胞株或組織純化的RNA），用以與所有其他樣品進(jìn)行比較，以確定某一基因的相對(duì)表達(dá)水平。標(biāo)定樣品可以是任何樣品，但通常是一個(gè)對(duì)照品（例如，未處理的樣品或來(lái)自實(shí)驗(yàn)零時(shí)的樣品）。

陽(yáng)性對(duì)照：使用已知量模板的對(duì)照反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照通常用來(lái)檢查引物集或引物–探針集工作是否正常，以及反應(yīng)是否正確設(shè)置。

無(wú)模板對(duì)照（NTC）：包含除模板之外的所有擴(kuò)增反應(yīng)所必要組分的對(duì)照反應(yīng)。這使得發(fā)現(xiàn)由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能，例如從以前的PCR中。

無(wú)RT對(duì)照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測(cè)不被設(shè)計(jì)為僅檢測(cè)和擴(kuò)增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進(jìn)行檢測(cè)。DNA污染可以通過(guò)操作在其中沒(méi)有加入逆轉(zhuǎn)錄酶的RT對(duì)照反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度或拷貝數(shù)，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的樣品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：要生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，CT值/不同標(biāo)準(zhǔn)稀釋的交叉點(diǎn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)輸入量的對(duì)數(shù)繪圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通常是使用至少5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋倍比生成。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，應(yīng)檢查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之間。標(biāo)準(zhǔn)是各濃度一式三份的理想測(cè)定值。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率如果與這些值差異較大則應(yīng)該舍棄。
 

效率和斜率：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率提供了對(duì)real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示該P(yáng)CR具有數(shù)值為1的效率，或100％的效率，并且PCR產(chǎn)物的量在每個(gè)循環(huán)增加到兩倍。效率小于–3.322（例如，–3.8）則表示PCR的效率<1。通常，大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的限制不能達(dá)到100％的效率。斜率大于–3.322（例如，–3.0）表明PCR效率似乎是大于100％的。當(dāng)在反應(yīng)中的非線(xiàn)性期對(duì)值進(jìn)行測(cè)量時(shí)可能發(fā)生這種情況，或者它可以指示是否有抑制劑存在。

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