那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關于蛋白純化方法，看看有你不會的嗎？
蛋白質(zhì)在組織或細胞中一般都是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千中不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項艱巨而繁重的任務,到目前為止,還沒有一個單獨的或一套xian成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合物中提取出來,但對任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當?shù)姆蛛x提純程序來獲得高純度的制品。
蛋白質(zhì)提純的總目標是設法增加制品純度或比活性,對純化的要求以合理的效率、速度、收率和純度,將需要蛋白質(zhì)從細胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來,同時仍保留有這種多肽的生物學活性和化學完整性。
蛋白質(zhì)分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟:
1、材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時,首先要把蛋白質(zhì)從組織或細胞中稀釋出來并保持原來的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:
(1)機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
(2)滲透破碎法這種方法是在低滲條件下使細胞溶脹而破碎。
(3)反復凍融法生物組織經(jīng)凍結(jié)后,細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。
(4)超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
(5)酶法如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
2、蛋白質(zhì)的抽提通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、triton X-100等),使膜結(jié)構(gòu)破壞,利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質(zhì)的變性。
3、蛋白質(zhì)粗制品的獲得選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法。
(1)等電點沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離。
(2)鹽析法不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。
(3)有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外,有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性,使用該法時,要注意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度。
4、樣品的進一步分離純化用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì),須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。
有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。
5、紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。利用一定波長下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關系,可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速、不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測,因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其優(yōu)良值。
此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差,干擾物質(zhì)多,在用標準曲線測定蛋白質(zhì)含量時,對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì),有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進行計算的方法,加以適當?shù)男Ｕ５且驗椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過校正,測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。
此外,進行紫外吸收法測定時,由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。
以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結(jié)關于蛋白純化方法，看看有你不會的嗎？
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